工程细胞构建、筛选、建库及检定一般要求

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工程细胞构建、筛选、建库及检定一般要求

在生物医药蓬勃发展的当下，单克隆抗体（mAb）已然成为肿瘤、自身免疫疾病及感染性疾病治疗领域不可或缺的核心药物。本文将深入剖析工程细胞构建的关键技术以及单克隆抗体制备的工业化流程，着重聚焦宿主细胞甄选、载体设计与质粒构建、转染技术、细胞池筛选评估、单克隆筛选评估、细胞库建立等核心环节。

宿主细胞选择

在抗体表达及工程细胞构建的起始阶段，宿主细胞的选择犹如奠基，至关重要。当前，生物医药领域中可用于抗体表达的宿主细胞表达系统涵盖原核与真核两大类别。其中，原核系统的大肠杆菌因缺乏翻译后修饰体系，主要适用于无需翻译后修饰的药物生产。而真核表达系统则异彩纷呈，包括CHO、293、小鼠骨髓瘤细胞系、酵母、昆虫、转基因植物等表达系统。在众多宿主细胞中，CHO 细胞凭借综合优势成为主流之选，在选择中，务必挑选来源清晰、历史背景有据可依且已获 FDA/EMA 等权威机构批准产品的宿主细胞，以此降低申报过程中的潜在风险。常见表达系统宿主类型及特征见表1。

表1常见表达系统宿主类型及特征

载体设计-质粒构建

宿主细胞选择完成后，需根据宿主细胞类型，目的基因特征选择合适的载体完成质粒构建。在质粒构建中，需对启动子、信号肽、linker、抗性筛选标记根据不同目的进行合适的筛选。

启动子

作为基因上游控制转录起始的 DNA 序列，与RNA聚合酶结合，控制转录的开始，当RNA聚合酶与启动子结合后，它会在启动子的引导下开始转录DNA，合成出mRNA，其选择对基因表达影响深远。

表2中举例了一些常见的启动子及特征，包括原核及真核启动子。真核启动子中CMV启动子的转录活性因增强子的存在使CMV启动子被认为是真核生物中最强的启动子之一。但CMV启动子转录的基因可能在某些细胞（如HESC、HiPS等）中被沉默，导致没有蛋白表达，具体的沉默机制暂不明确。

表2常见启动子及特征

信号肽

这是一段位于蛋白质 N 端的特殊序列，肩负引导新生蛋白质进入内质网进行折叠和修饰的重任，通常由 15 - 30 个氨基酸残基构成，分为 N 端、H 端和 C 端三个区域。N 端区域含 1 - 5 个带正电荷的碱性氨基酸残基，利于与核糖体结合；H 端区域由 7 - 15 个疏水性残基组成，构成疏水核心，依靠疏水力嵌入内质网膜；C 端区域含 5 - 6 个极性较强的残基，且包含信号肽切割位点，对信号肽成熟及从核糖体释放不可或缺。

linker选择

可分为柔性 Linker、刚性 Linker、可剪切 Linker以及内部核糖体进入位点（如 IRES 元件，可实现蛋白结构域分别表达）。

选择标记

筛选标记在细胞筛选中至关重要。嘌呤霉素通过干扰翻译抑制蛋白合成，杀稻瘟菌素干扰核糖体肽键形成，潮霉素 B 和遗传霉素分别通过干扰核糖体和抑制其功能来阻止蛋白合成，氨甲喋呤作为叶酸拮抗剂阻断核酸合成，蛋氨酸亚氨基代砜则通过抑制内源性基因筛选出成功转染的细胞。它们各具特点，为筛选出符合要求的细胞株提供有效手段。